Wie funktioniert der "Corona-Test"?
SARS-CoV-2 und COVID-19
22. März 2020
Das neuartige Coronavirus SARS-CoV-2 ist erst seit wenigen Monaten bekannt. Es hat nicht lange gedauert, bis das Erbgut des Virus, also seine Genomsequenz, entschlüsselt wurde, und ein zuverlässiges Nachweisverfahren für eine Virusinfektion vorlag.
Die Nachrichten sind voll mit Informationen über das neuartige Coronavirus SARS-CoV-2 und die dadurch ausgelöste Erkrankung COVID-19. Aus diesem Grund soll hier nur eine kurze Übersicht zur zeitlichen Einordnung präsentiert werden:
Im Dezember 2019 wurden in der chinesischen Stadt Wuhan, Hauptstadt der Provinz Hubei, vermehrt Patienten mit einer schweren Lungenentzündung behandelt. Mehrere Erkrankte arbeiteten auf dem örtlichen „Südchinesischen Markt für Fische und Meeresfrüchte“, wodurch dieser Markt als Infektionsort mit einem neuen, unbekannten Krankheitserreger in Betracht gezogen wurde. Wenig später wurde als Ursache für die Erkrankungen ein neues Virus aus der Familie der Coronaviren entdeckt [1, 2]. Mitte Januar wurde das Erbgut des Virus entschlüsselt und die komplette Genomsequenz, also die Reihenfolge der einzelnen Nucleotide (= Bausteine des Erbguts) des neuen Virus namens SARS-CoV-2 in einer Internetdatenbank veröffentlicht [2, 3]. Gleichzeitig wurde ein erstes Nachweisverfahren einer Infektion mit dem neuartigen Virus präsentiert, umgangssprachlich als „Corona-Test“ bezeichnet [4].
Wie funktioniert der "Corona-Test"?
Die entscheidende Voraussetzung für ein spezifisches Nachweisverfahren einer Infektion mit SARS-CoV-2 ist die entschlüsselte Genomsequenz. Coronaviren sind RNA-Viren, weshalb auch das Genom von SARS-CoV-2 aus einzelsträngiger RNA besteht. DNA und RNA besitzen vier verschiedene Bausteine, die Nucleotide, welche in unterschiedlicher Reihenfolge angeordnet sind und somit eine für jeden Organismus einzigartige Sequenz bilden. Während bei DNA die Nucleotide Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin vorkommen, beinhaltet RNA statt Thymin das Nucleotid Uracil. Einzig bei manchen Viren besteht das Erbgut aus RNA. In allen anderen Lebewesen ist das Erbgut aus DNA aufgebaut. Das Erbgut von SARS-CoV-2 ist knapp 30.000 Nucleotide lang und enthält vermutlich die Informationen für zehn Proteine, unter anderem Proteine der Virushülle und das Protein zur Verpackung des Virusgenoms [2, 3]. Die Reihenfolge, in der die Gene auf dem Genom angeordnet sind, entspricht der aller Coronaviren [5]. Vergleiche mit den Genomsequenzen anderer Coronaviren zeigen eine Übereinstimmung mit Coronaviren aus Fledermäusen von fast 90%. Der Proteinabschnitt, der für die Bindung an die Oberflächenrezeptoren der Zielzelle im Menschen benötigt wird und somit den Eintritt in die Wirtszelle erlaubt, ähnelt hingegen am meisten einigen Coronaviren von Schuppentieren. Auch wenn der exakte Ursprung von SARS-CoV-2 noch nicht endgültig geklärt
worden ist, sei an dieser Stelle erwähnt, dass eine künstliche Erzeugung im Labor, wie es einige Theorien vermuten, wohl ausgeschlossen werden kann [6].
Das Nachweisverfahren für SARS-CoV-2 muss somit sehr genau sein, um ausschließlich das neuartige Coronavirus zu erkennen, nicht aber andere, nahverwandte Coronaviren. Dafür wird eine molekularbiologische Standardmethode verwendet: quantitative real-time PCR , qRT-PCR; auf deutsch quantitative Echtzeit-PCR. PCR steht hierbei für polymerase chain reaction , Polymerase Kettenreaktion [4, 7].
Ausgangsmaterial für das Nachweisverfahren ist das RNA-Erbgut des Virus. Um zunächst an das Virus heranzukommen, wird meist ein Rachenabstrich beim Patienten vorgenommen. Das Virus findet sich aber auch im Bronchialsekret oder ausgehusteten Absonderungen. Für einen Abstrich werden spezielle „Virustupfer“ verwendet, an denen das Virus haften bleibt. Die Proben müssen dann schnellstmöglich und gekühlt zu einem Analyselabor gesendet werden. Da die Probe als „Biologischer Stoff, Kategorie B" behandelt wird, muss der „Virustupfer“ dreifach verpackt werden: die erste Verpackung bildet das Tupferröhrchen, in welches der Tupfer gesteckt wird; dieses kommt in ein weiteres, flüssigkeitsdicht verschraubtes Schutzgefäß; um dieses kommt zuletzt die Außenverpackung [8]. Zurzeit (22.03.2020) stehen in Deutschland 47 Labore zur Verfügung, die den „Corona-Test“ zuverlässig und reproduzierbar durchführen können [9]. In den Laboren angekommen wird das Erbgut des Virus zunächst extrahiert und dann das Nachweisverfahren mittels quantitativer Echtzeit-PCR vorgenommen. Dabei gilt die biologische Schutzstufe 2 [8]. Wie funktioniert die quantitative Echtzeit-PCR?
Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Fangen wir mit der Funktionsweise der PCR an: Die PCR dient dazu, Abschnitte des Erbmaterials DNA im Reagenzglas zu vervielfältigen. Auf diese Weise wird nur eine geringe Anfangsmenge DNA benötigt und über mehrere enzymatische Reaktionsschritte ein Vielfaches an exakten Kopien dieser DNA erzeugt. Die vervielfältigte DNA kann anschließend für weitere Untersuchungen wie das Überprüfen des genetischen Fingerabdrucks in der Forensik, das Klonieren von Genen in der Forschung oder dem Nachweis von Virusinfektionen oder Erbkrankheiten in der Medizin verwendet werden. Die PCR ist somit eine der wichtigsten Standardmethoden in der Molekularbiologie; ihr Erfinder Kary Mullis wurde dafür 1993 mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt [10].
Für eine PCR werden folgende Komponenten benötigt:
Natürlich die zu vervielfältigende DNA, die vorher aus Zellen extrahiert und aufgereinigt wird. Dabei werden Zellen, die die DNA enthalten, chemisch zerstört und deren Proteine abgebaut. Die DNA wird anschließend durch alkoholische Lösungen mit saurem pH-Wert gelöst und gewaschen.
Weiterhin werden für die PCR zwei sogenannte Primer benötigt. Dabei handelt es sich um kurze, einzelsträngige DNA-Moleküle aus 15 bis 30 Nucleotiden, die in ihrer Sequenz komplementär zur zu vervielfältigenden DNA sind. Das heißt, sie sind durch die Reihenfolge ihrer Nucleotide in der Lage an einen einzelnen DNA-Strang der zu vervielfältigenden DNA zu binden, wobei immer die Nucleotide Adenin und Thymin sowie Guanin und Cytosin miteinander paaren. Die Primer geben den DNA-Abschnitt vor, der vervielfältigt wird. Die DNA-Sequenz, die für spätere Untersuchungen benötigt wird, muss also von den beiden genutzten Primern eingeschlossen werden, da nur der DNA-Abschnitt innerhalb der Primer durch die PCR vervielfältigt wird.
Das Kernstück der PCR ist das Enzym DNA-Polymerase. Dieses Enzym kommt in fast allen Lebewesen vor und verdoppelt das Erbgut bei jeder Zellteilung, sodass die neu entstehende Zelle eine exakte Kopie der DNA der ursprünglichen Zelle erhält. Das Enzym DNA-Polymerase ist aber nicht nur in der Zelle aktiv, sondern auch in geeigneten Reaktionslösungen, sodass sie für die PCR im Reagenzglas genutzt werden kann.
Weitere benötigte Komponenten sind also die richtige Reaktionslösung, in der die DNA-Polymerase gut funktioniert, sowie Magnesium-Ionen, die die DNA-Polymerase benötigt.
Als letztes werden noch die Bausteine für die vielen Kopien der Anfangs-DNA, die die DNA-Polymerase während der PCR erstellt, benötigt: die Desoxyribonucleosidtriphosphate.
Sind alle Komponenten in einem Reaktionsgefäß vereint, kann es losgehen. Die PCR funktioniert über die sich wiederholenden drei Schritte Denaturierung, Primer-Bindung und Verlängerung, die jeweils unterschiedliche Temperaturen benötigen. Aus diesem Grund wird die PCR in einem Thermocycler durchgeführt, einem Gerät, das in der Lage ist, das Reaktionsgefäß auf die unterschiedlichen Temperaturen zu erwärmen bzw. abzukühlen. Bei der Denaturierung wird die doppelsträngige Anfangs-DNA auf 94 bis 98°C erhitzt, wodurch sich beide DNA-Stränge voneinander trennen und zwei einzelsträngige DNA-Stränge mit komplementärer Sequenz vorliegen. Im nächsten Schritt wird das Reaktionsgefäß auf eine Temperatur zwischen 50 und 70°C abgekühlt, was die Bindung der Primer an die DNA-Einzelstränge ermöglicht. Im dritten Schritt bei einer Temperatur von etwa 70°C bindet die DNA-Polymerase an einen der Primer und nimmt diesen als Startpunkt, um den DNA-Einzelstrang zu einem DNA-Doppelstrang aufzufüllen bzw. zu verlängern, indem sie die frei vorliegenden Desoxyribonucleosidtriphosphate komplementär einbaut. Die Primer bilden also den Anfangspunkt für den neu gebildeten Einzelstrang, weswegen sie den DNA-Abschnitt vorgeben, der kopiert wird. Da jeder Primer nach dem Schritt der Denaturierung an einen Einzelstrang bindet, werden aus einem doppelsträngigen DNA-Molekül nach einem Durchlauf der Reaktion zwei doppelsträngige DNA-Moleküle. Die drei Schritte Denaturierung, Primer-Bindung und Verlängerung werden anschließend zwischen 30- und 50-mal wiederholt. Dabei handelt es sich um eine exponentielle Reaktion. Liegt am Anfang nur ein doppelsträngiges DNA-Molekül vor, werden daraus nach dem ersten Durchlauf zwei Moleküle. Für den nächsten Durchlauf liegen als Ausgangsmaterial dadurch schon zwei DNA-Moleküle vor, aus denen dann vier Moleküle werden. Aus diesen vier werden im nächsten Durchlauf acht, dann 16, dann 32, 64, 128, 256, 512, 1024, usw. Das heißt, dass aus nur einem einzigen DNA-Molekül nach 30 Durchläufen 2 hoch 30, also 1.073.741.824 DNA-Moleküle werden.
Ein Video zur Polymerase Kettenreaktion (von User "MPIMP Potsdam Golm", hochgeladen am 26.06.2018):
Ein Video zur quantitativen Echtzeit-PCR (englisch; von User "Shomu's Biology", hochgeladen am 30.06.2016):
Quantitative Echtzeit-PCR
Zurück zum „Corona-Test“. Da Coronaviren RNA-Viren sind, besteht ihr Erbgut nicht aus DNA, sondern aus RNA. Um das RNA-Erbgut mittels PCR zu vervielfältigen, muss dieses erst in DNA umgeschrieben werden. Dafür wird das Enzym Reverse Transkriptase verwendet, welches in der Lage ist, RNA als Vorlage zu nutzen, um daraus eine doppelsträngige DNA mit gleicher Sequenz herzustellen. Dieses Enzym wird beispielsweise von Retroviren mit RNA-Erbgut verwendet, um ihr Erbgut in DNA umzuschreiben und es anschließend in das Erbgut der Wirtszelle einzubauen. Außerdem verwenden Retrotransposons dieses Enzym, um innerhalb des Erbguts zu „springen“. Mehr Informationen dazu gibt es im Artikel „Wenn Gene wandern: Transposons“. Die mittels Reverse Transkriptase erzeugte DNA kann anschließend wie oben beschrieben mittels PCR vervielfältigt werden.
Was verbirgt sich hinter der für den „Corona-Test“ verwendeten quantitativen Echtzeit-PCR? Bei dieser Art der PCR wird dem Reaktionsgemisch ein Fluoreszenzfarbstoff beigemischt, der durch die Herstellung der DNA-Kopien aktiv wird und dessen Fluoreszenz-Signal im Verhältnis zu der Anzahl der angefertigten DNA-Kopien ansteigt. Dieses Signal wird nach jedem Durchlauf (Denaturierung, Primer-Bindung, Verlängerung) von einer Maschine gemessen und als Graph dargestellt. Auf diese Weise erhält man schon während die PCR abläuft, in Echtzeit, die Menge der vervielfältigten DNA-Moleküle. Mit Hilfe der richtigen Kontrollen kann mit der Echtzeit-PCR auch die Menge an vervielfältigter DNA berechnet werden, sowohl relativ zu einem anderen Gen als auch absolut. Deshalb trägt diese PCR-Methode den Zusatz quantitativ. Das wird besonders häufig für Vergleiche der Genexpression verwendet. Dabei kann herausgefunden werden, wie häufig ein Gen abgelesen und in mRNA übersetzt wird. Auch hierfür wird aus der Zelle RNA extrahiert, mit der Reversen Transkriptase in DNA umgeschrieben und dann mittels quantitativer Echtzeit-PCR untersucht. Für den „Corona-Test“ ist die Verwendung der Echtzeit-PCR nicht zwingen nötig, spart aber Zeit. Würde die Vervielfältigung der DNA, also das Produkt der PCR, nicht in Echtzeit angeschaut werden, so müsste das Endprodukt sichtbar gemacht werden. Dazu wird häufig die Agarose-Gelelektrophorese genutzt, bei der das PCR-Gemisch auf ein Agarose-Gel aufgetragen wird. Mittels angelegten Stroms wandert dann die negativ geladene DNA durch das Gel. Auf diese Weise können DNA-Moleküle unterschiedlicher Länge ihrer Länge nach aufgetrennt werden, da kürzere Moleküle schneller durch das Gel laufen als lange. Auch hier wird ein Farbstoff hinzugegeben, der sich im DNA-Doppelstrang anlagert und durch Bestrahlung mit UV-Licht sichtbar gemacht werden kann. Dieser Schritt entfällt bei der Echtzeit-PCR, wodurch Zeit gespart wird. Eine Quantifizierung, also Feststellung der exakten Menge an Viren-RNA in einem infizierten Menschen, ist beim „Corona-Test“ ebenfalls unnötig, da es nur darum geht, ob überhaupt Viren-RNA vorliegt und mittels PCR vervielfältigt werden konnte.
Für den „Corona-Test“ wird übrigens ein Reaktionsgemisch genutzt, bei dem sowohl das Enzym Reverse Transcriptase als auch DNA-Polymerase vorliegt [4, 11]. Dadurch kann direkt die extrahierte Viren-RNA genutzt werden, welche im gleichen Reaktionsgemisch von der Reversen Transkriptase in DNA umgeschrieben und anschließend von der DNA-Polymerase vervielfältigt wird.
Ähnliche Artikel:
Was macht den "Corona-Test" spezifisch für SARS-CoV-2?
Damit die PCR ausschließlich das Erbgut von SARS-CoV-2 vervielfältigt und nicht auch das sämtlicher anderer Viren, die bei dem durchgeführten Rachenabstrich ebenfalls auf den Tupfer gelangt sind, müssen die Primer für die PCR genau ausgewählt werden. Diese dürfen nur zur Genomsequenz von SARS-CoV-2 passen, nicht jedoch zum Erbgut anderer Viren. Daher ist wichtig, dass die Genomsequenz des neuartigen Coronavirus bekannt ist [4, 7]. Hier kann nach Abschnitten gesucht werden, die für SARS-CoV-2 einzigartig sind und Primer hergestellt werden, die genau an solche Abschnitte der DNA binden. Im Erbgut anderer Viren fehlen diese Abschnitte und die Primer würden bei der PCR nicht binden und es wird keine DNA vervielfältigt. Falsche, negative Ergebnisse können jedoch durch eine schlechte Qualität der Probe oder eines ungeeigneten Transports der Probe verursacht werden, wenn diese beispielsweise nicht gekühlt wird. Eine weitere Möglichkeit einer nicht erkannten Infektion mit SARS-CoV-2 könnte eine Mutation im Virengenom sein [8]. Ändert sich die Sequenz des Erbguts, binden die Primer nicht mehr an den Einzelstrang und es kann keine DNA mittels PCR vervielfältigt werden.
Wie lange dauert der "Corona-Test"?
Hat die Ärztin oder der Arzt den Abstrich vorgenommen, dauert es zwischen ein und zwei Tagen, bis die Ergebnisse vorliegen. Die eigentliche qRT-PCR dauert etwa eineinhalb Stunden. Hinzu kommt die Zeit der Probenaufbereitung. Die meiste Zeit nimmt das Versenden der Proben und die weitere Logistik der Ergebnisse des Tests in Anspruch [12]. Weitere Testmethoden und insbesondere Schnelltests für eine Infektion mit SARS-CoV-2 befinden sich momentan noch in der Entwicklung. Dabei handelt es sich entweder um schnellere Nachweisverfahren oder tragbare Diagnosegeräte.
Quellen
1. Zhou, Peng, et al., A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature, 2020. 579(7798): p. 270-273.
2. Wu, Fan, et al., A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature, 2020. 579(7798): p. 265-269.
3. Wu, Fan, et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome. 2020. Quelle: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947.3. Zuletzt aufgerufen: 22.03.2020.
4. Corman, Victor, et al. Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. 2020. Quelle: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2. Zuletzt aufgerufen: 22.03.2020.
5. Frieman, Matthew and Ralph Baric, Mechanisms of Severe Acute Respiratory Syndrome Pathogenesis and Innate Immunomodulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2008. 72(4): p. 672-685.
6. Andersen, Kristian G., et al., The proximal origin of SARS-CoV-2. Nature Medicine, 2020.
7. World Health Organization. Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Laboratory testing for 2019-nCoV in humans. 2020. Quelle: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance. Zuletzt aufgerufen: 22.03.2020.
8. Robert-Koch-Institut. Hinweise zur Testung von Patienten auf Infektion mit dem neuartigen Coronavirus SARS-CoV-2. 2020. Quelle: https://www.rki.de/DE/Content/InfAZ/N/Neuartiges_Coronavirus/Vorl_Testung_nCoV.html#doc13490982bodyText4. Zuletzt aufgerufen: 22.03.2020.
9. Gesellschaft für Virologie e.V. Diese Institute bieten den SARS-CoV-2 PCR Test an. 2020. Quelle: https://www.g-f-v.org/node/1233.
10. Wikipedia. Kary Mullis. 22.03.2020]; Available from: https://de.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullis. Zuletzt aufgerufen: 22.03.2020.
11. Scientific, Thermo Fisher. SuperScript™ III One-Step RT-PCR System with Platinum™ Taq DNA Polymerase. Quelle: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12574026#/12574026. Zuletzt aufgerufen: 22.03.2020.
12. (online), DER SPIEGEL. Neues Coronavirus - So funktioniert der Schnelltest. 2020. Quelle: https://www.spiegel.de/wissenschaft/medizin/coronavirus-wie-funktioniert-der-schnelltest-a-7aae7113-3178-451b-875d-9245b4401253. Zuletzt aufgerufen: 22.03.2020.
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