Corona-Test mit Genschere
Schnelle Corona-Tests durch CRISPR/Cas und Smartphone
1. Februar 2021
Das Coronavirus SARS-CoV-2 hält uns weiterhin fest in Schach. Zwar verursacht eine Infektion mit SARS-CoV-2 bei den meisten Menschen nur leichte oder sogar gar keine Symptome, aber es sind gerade diese asymptomatischen oder wenig symptomatischen Träger, die die Gefahr bergen, das Virus zu verbreiten, was zu einer verzögerten Isolierung der Infizierten und einer weltweiten Ausbreitung führt [1-5]. In Deutschland werden pro Woche über eine Millionen PCR-Tests auf Infektionen mit SARS-CoV-2 durchgeführt [6]. Allerdings sind die Tests auf symptomatisch erkrankte Menschen beschränkt, sodass viele Menschen nicht getestet werden. Die alternativen Antikörpertests bieten meist nicht dieselbe Sensitivität wie ein PCR-Test [7]. Modellierungen weisen darauf hin, dass häufiges Testen mit schneller Durchlaufzeit notwendig ist, um die aktuelle Pandemie zu durchbrechen [8]. Hier könnten Corona-Testverfahren auf Basis von CRISPR/Cas Abhilfe schaffen. Ein solches Testverfahren kann sogar mit dem Smartphone ausgewertet werden [9].
Seit Ende 2019 ist das neue, infektiöse RNA-Virus SARS-CoV-2 bekannt [10, 11]. Seitdem haben sich weltweit über 95 Millionen Menschen mit dem Virus infiziert und über zwei Millionen Menschen sind an den Folgen der Infektion gestorben (Stand 22.01.2021) [12]. Bei den meisten Infizierten treten nur leichte oder sogar gar keine Krankheitssymptome auf. Kritisch ist jedoch, dass asymptomatische oder wenig symptomatische Träger das Virus verbreiten können und somit die Isolierung der Infizierten verzögern und die weitere Ausbreitung des Virus begünstigen [1-5]. Diese stille Übertragung des Virus hat zur Infektion von Personen geführt, die aufgrund von Alter oder Vorerkrankungen wie Diabetes, Krebs, Fettleibigkeit, Immunsuppression oder Herz-, Lungen- und Nierenerkrankungen ein erhöhtes Risiko für eine schwere Erkrankung haben [13]. Das derzeitige Standardverfahren in der Diagnostik für SARS-CoV-2-Infektionen ist die quantitative real-time Polymerase Kettenreaktion, kurz qRT-PCR. Diese gut etablierte Methode basiert auf dem Nachweis von bestimmten Genen im Erbgut des SARS-CoV-2 Virus [14-24]. Die eigentliche qRT-PCR dauert gerade einmal eineinhalb Stunden. Da das Verfahren aber in einem Labor durchgeführt werden muss, kommen Transport und Bearbeitungszeiten hinzu, die die Zeit zwischen Probenentnahme und Ergebnis unter Umständen auf mehrere Tage ausdehnen [25].
Mittlerweile werden einige Schnelltests, sogenannte
Antikörpertests, angeboten. Diese Tests liefern das Ergebnis zwar schneller, erkennen jedoch sowohl infizierte Personen schlechter (niedrigere Sensitivität) als auch nicht-infizierte Personen schlechter (niedrigere Spezifizität) als qRT-PCR-Tests [7]. Modellierungen der viralen Dynamik deuten darauf hin, dass häufige Tests mit einer schnellen Durchlaufzeit erforderlich sind, um die aktuelle Pandemie zu durchbrechen [8]. Es werden also Testverfahren benötigt, die schnell, weit verbreitet und gleichzeitig sehr genau sind. Bemühungen gehen nun in die Richtung von Testverfahren auf Basis der CRISPR/Cas-Technik [26-29]. Anstelle des mittlerweile breit genutzten CRISPR/Cas9-Verfahrens nutzen die Tests die Proteine Cas12 und Cas13 [30]. Mit einigen solcher Tests kann die virale RNA direkt nachgewiesen werden und eine vorherige Vervielfältigung des viralen Genoms ist nicht mehr nötig [9]. Besonders praktisch: Bei einem dieser Verfahren kann die Auswertung des Tests über die Smartphone-Kamera erfolgen [9].
CRISPR/Cas ist mehr als Cas9 und Genome Editing
Die CRISPR/Cas-Methode ist vor allem für den Einsatz beim Genome Editing, also dem gezielten verändern von DNA, bekannt [31-33]. CRISPR steht für “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats” und Cas für “CRISPR associated” (CRISPR assoziiert/zugehörig). Es handelt sich dabei um eine Art bakterielles Immunsystem, das dem Bakterium eine Resistenz gegen das Eindringen fremden Erbguts von Viren oder Plasmiden verschafft [34]. Ohne zu tief ins Detail gehen zu wollen, kann der CRISPR/Cas-Mechanismus wie folgt zusammengefasst werden: Im Erbgut von Bakterien befinden sich mehrere CRISPR-Abschnitte, also sich wiederholende DNA-Sequenzen, die meist palindromisch (also spiegelverkehrt komplementär) sind. Zwischen den CRISPR-Abschnitten befinden sich sogenannte Spacer. Diese Spacer-DNA-Sequenzen sind mit den Sequenzen aus dem Erbgut einiger Viren identisch. Zu guter Letzt gibt es noch cas -Gene, die unter anderem die Informationen zur Ausbildung einer Genschere, also eines DNA- oder RNA-schneidenden Enzyms, enthalten [35]. Von diesen Cas-Genscheren gibt es mehrere verschiedene, die sich in ihren Eigenschaften leicht unterscheiden; dazu kommen wir gleich. Am häufigsten wird über die Genschere Cas9 berichtet, welche mittlerweile weltweit für allerlei Experimente genutzt wird [30].
Befällt nun ein Virus das Bakterium und eine der Spacer-Sequenzen im Erbgut des Bakteriums ist identisch zu Abschnitten des Virus-Erbguts, verleiht CRISPR/Cas dem Bakterium Immunität gegen dieses Virus. Die zum Virus-Erbgut identische Spacer-Sequenz im Erbgut des Bakteriums wird zusammen mit einem CRISPR-Abschnitt abgelesen, sodass sie eine stabile RNA-Struktur bilden, die sogenannte CRIPSR-RNA (crRNA). Gleichzeitig wird das Cas-Enzym, also die Genschere, hergestellt, die sich mit der crRNA verbindet. Das Cas-Enzym wird jetzt zum Virus-Erbgut geführt und der Spacer-Abschnitt der crRNA bindet an den zu ihm passenden Abschnitt im Virus-Erbgut. Anschließend schneidet das Cas-Enzym den DNA-Strang des Virus und macht ihn auf diese Weise unschädlich [34]. Wichtig ist also, dass die Spacer-Sequenz bzw. crRNA die Stelle bestimmt, an der das Cas-Enzym das Erbgut des Virus schneidet. Bringt man das CRISPR/Cas-System in pflanzliche, tierische oder menschliche Zellen ein, kann man die Spacer-Sequenz bzw. crRNA gezielt austauschen, sodass jeder beliebige DNA-Abschnitt geschnitten werden kann [31, 35, 36]. Ein Schnitt in der DNA wird von der Zelle versucht zu reparieren. Dabei passieren aber häufig Fehler, sodass Mutationen entstehen, die das an dieser Stelle befindliche Gen ausschalten. Ein gezielter Schnitt in der DNA kann aber auch dazu genutzt werden, bestehende Gensequenzen zu ändern oder neue Gensequenzen in die DNA einzubauen [31].
Genome Editing mit CRISPR/Cas9
Ein Video der Max-Planck-Gesellschaft (Username "MaxPlanckSociety"; hochgeladen am 10.02.2016) erklärt die Funktionsweise von CRISPR/Cas9 als bakterielles Abwehrsystem gegen Phagen und zeigt, wie sich dieses System anwenden lässt, um gezielte DNA-Veränderungen vorzunhemen.
So weit so gut. CRISPR/Cas ist also ursprünglich ein bakterielles Immunsystem, das in nahezu allen Organismen genutzt werden kann, um DNA-Sequenzen zu schneiden. Auf diese Weise können Gene ausgeschaltet, repariert und ausgetauscht werden. Wie könnte diese Funktion für einen Virustest genutzt werden? An dieser Stelle kommen die unterschiedlichen Cas-Enzyme ins Spiel. Die am häufigsten genutzte Genschere ist Cas9. Das Enzym Cas9 macht einen glatten Schnitt durch einen DNA-Doppelstrang, und eignet sich hervorragend für Genome Editing.
Es gibt aber auch die Genschere Cas12. Der Mechanismus funktioniert bei Cas12 im Grunde genauso wie bei Cas9. Auch das Cas12-Enzym wird über eine crRNA zur Ziel-DNA geführt und schneidet diese. Im Gegensatz zu Cas9 fabriziert Cas12 keinen glatten Schnitt durch den DNA-Doppelstrang, sondern einen versetzten Schnitt. Hinzu kommt noch eine besondere Eigenschaft von Cas12. Wird es durch eine passende crRNA zum Ziel geführt und somit aktiviert, schneidet Cas12 nicht nur die Ziel-DNA, sondern auch einzelsträngige DNA-Moleküle in seiner Umgebung. Noch spezieller ist die Genschere Cas13. Dieses Enzym schneidet keine DNA, sondern einzelsträngige RNA. Wird Cas13 über eine crRNA zur Ziel-RNA geführt, schneidet das Enzym aber nicht nur diesen RNA-Strang, sondern zusätzlich alle umliegenden RNA-Moleküle, unabhängig von ihrer Sequenz [30, 37].
Man könnte annehmen, dass diese willkürliche Zerstörung umliegender DNA- oder RNA-Moleküle durch Cas12 bzw. Cas13 eine eher unbrauchbare Funktion dieser Genscheren ist. Doch genau diese Eigenschaften machen die beiden Enzyme für diagnostische Zwecke so bedeutsam.
Aufbau und Eigenschaften verschiedener CRISPR/Cas-Systeme
Es gibt verschiedene CRISPR/Cas-Systeme, die nach ihrer molekularen Verwandtschaft klassifiziert werden. Ein CRISPR-Cas-System besteht aus drei Komponenten: Die CRISPR-RNA (crRNA) erkennt mit ihrer von einem früheren Virusangriff stammender Spacer-Sequenz einen passenden (komplementären) Abschnitt auf einer Fremd-DNA (im Fall von Cas13 handelt es sich um Fremd-RNA). Die Trans-activating crRNA (tracrRNA) bildet zusammen mit der crRNA eine stabile, Haarnadel-ähnliche Struktur aus. crRNA und tracrRNA werden gemeinsam auch als gudie-RNA bezeichnet. Die guide-RNA führt das Cas-Enzym, also die Genschere, zur Ziel-DNA (oder zur Ziel-RNA). Das Cas-Enzym durchtrennt anschließend die beiden DNA-Stränge (oder den einzelnen RNA-Strang). Hierfür muss in unmittelbarer Nähe ein weiterer kurzer Erkennungsabschnitt vorhanden sein, das sogenannte protospacer adjacent motif (PAM). Abbildung entlehnt von [37].
Wie kann CRISPR/Cas für den Nachweis einer Virusinfektion genutzt werden?
Forschende arbeiten zurzeit an mehreren Ansätzen, um die Systeme CRISPR/Cas12 und CRISPR/Cas13 für den Nachweis von Viren zu nutzen [26-29, 38-42]. Das Prinzip ist bei allen Ansätzen gleich und lässt sich wie folgt beschreiben: Das Enzym Cas12 oder Cas13 wird mit der crRNA so programmiert, dass es das Erbgut eines ganz bestimmten Virus erkennt. Cas12 wird somit zu ganz bestimmten Abschnitten doppelsträngiger DNA geführt und schneidet diese, während Cas13 zu einzelsträngigen RNA-Abschnitten geführt wird und diese schneidet. Um das zu erreichen, müssen in einem kleinen Reagenzglas nur das jeweilige Enzym, also Cas12 oder Cas13, das Erbgut des Virus (in Form von DNA oder RNA) und die spezifische crRNA zusammengemischt werden. Hinzu kommen Reporter-Moleküle, die die Aktivität der Genschere und somit die Anwesenheit des Virus anzeigen [43].
Ein solches diagnostisches Verfahren wird SHERLOCK genannt, was für „Specific High Sensitivity Reporter unLOCKing“ steht [38, 39]. Beim SHERLOCK-Testverfahren wird die Probe einer eventuell infizierten Person genommen und die in der Probe vorhandene Viren-RNA vervielfältigt. Zu dieser Probe werden anschließend die Reporter-Moleküle und die Genschere Cas13 hinzugegeben [38, 39]. Was sind die Reporter-Moleküle? Es handelt sich hierbei um kurze, einzelsträngige RNA-Moleküle, an deren Enden jeweils ein Fluorophor und ein Quencher angebracht sind. Ein Fluorophor ist ein Molekül, das bei Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge dieses Licht absorbiert und daraufhin wiederum Licht einer anderen Wellenlänge aussendet. Ein Quencher ist ein Molekül, das das vom Fluorophor ausgesendete Licht absorbiert und die dadurch aufgenommene Energie in Form von Wärme abgibt. Durch das RNA-Molekül sind Fluorophor und Quencher räumlich so nah beieinander, dass der Quencher das vom Fluorophor ausgesendete Licht dauerhaft absorbiert. Erst wenn Fluorophor und Quencher voneinander getrennt sind, wird das vom Fluorophor ausgesendete Licht nicht mehr absorbiert und kann stattdessen detektiert werden. Im Grunde kann das Fluorophor also für eine Lichtreaktion genutzt werden; solange es sich jedoch nahe beim Quencher befindet, wird dieses Lichtsignal unterdrückt [43].
Hier kommt die Eigenschaft von Cas13 ins Spiel, wahllos weitere RNA-Moleküle zu zerschneiden, wenn es einmal aktiviert ist. In der Probe befindet sich das Cas13-Enzym und die crRNA zum Nachweis eines bestimmten Virus. Befindet sich dieses Virus tatsächlich in der Probe, führt die crRNA die Genschere Cas13 zum passenden RNA-Abschnitt des Virus-Erbguts und aktiviert somit das Enzym. Cas13 schneidet anschießend nicht nur das Erbgut des Virus, sondern auch die einzelsträngige RNA der umliegenden Reporter-Moleküle. Dadurch werden wiederum Fluorophor und Quencher voneinander getrennt und die Fluorophore senden Licht aus, das detektiert werden kann. Neben solchen fluoreszierenden Reportern - also Reportern, die bei erfolgreichem Durchschneiden Licht aussenden - können auch Reporter genutzt werden, die vor und nach dem Schneiden durch Cas13 aufgrund ihrer Größe unterschieden werden können. Diese können dann mit einem Lateral Flow Test nachgewiesen werden, wie er auch bei
Antikörperschnelltests zum Nachweis von SARS-CoV-2 eingesetzt wird [38, 39].
In einer Weiterentwicklung des SHERLOCK-Tests wird nicht nur ein Cas13-Enzym verwendet, sondern gleich drei verschiedene Cas13-Enzyme sowie das Enzym Cas12. Dadurch können in der gleichen Probe mehrere verschiedene Viren nachgewiesen werden, weil die einzelnen Genscheren unterschiedliche Reporter-Moleküle schneiden, die man voneinander unterscheiden kann [39]. Mit dem SHERLOCK-Verfahren konnte auch das SARS-CoV-2 Virus nachgewiesen werden [26, 27, 29].
Verwendung von CRISPR/Cas zum Nachweis von Viren
Es wurden mehrere Verfahren entwickelt, um CRISPR/Cas-Systeme für den Nachweis viraler Infektionen zu nutzen. Bei der Methode DETECTR (DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter) kommt das System CRISPR/Cas12 zum Einsatz. Virales Erbgut wird isoliert und vervielfältigt und anschließend mit dem Enzym Cas12 und einer guide-RNA zusammengegeben. Die guide-RNA führt Cas12 zu der passenden DNA-Sequenz im Erbgut des Virus, nach dem gesucht werden soll (Ziel-DNA). Zusätzlich befinden sich in der Probe Reporter-Moleküle, ein einzelsträniges (ss) DNA-Konstrukt mit einem Fluorophor- und einem Quencher-Molekül. In Abwesenheit der Ziel-DNA ist Cas12 inaktiv und der Quencher absorbiert die vom Fluorophor erzeugten Emissionen, wodurch kein Lichtsignal detektiert werden kann. Befindet sich die Ziel-DNA in der Probe, führt die guide-RNA das Cas12-Enzym zu der passenden DNA-Sequenz und aktiviert die Genschere. Aktiviertes Cas12 durchtrennt nicht nur die Ziel-DNA, sondern auch das ssDNA-Konstrukt des Reporter-Moleküls.
Durch die Trennung von Fluorophor und Quencher, kann die vom Fluorophor erzeugte Lichtemission detektiert werden und dient als Nachweis für die Anwesenheit der Virus-DNA in der Probe [41].
Die Methode SHERLOCK (specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking) ist dem DETECTR-Verfahren sehr ähnlich. Bei SHERLOCK wird das System CRISPR/Cas13 verwendet. Cas13 erkennt und schneidet ssRNA-Konstrukte, weshalb in der Probe virale RNA nachgewiesen werden kann und auch die Reporter-Moleküle Fluorophor und Quencher über ein ssRNA-Konstrukt miteinander verknüpfen. In der Originalpublikation wurden zwei ssRNA-Konstrukte entworfen, von denen eines von Cas13 und eines von einem anderen Cas-Enzym, Csm6, gespalten wird. Csm6 wird durch die Spaltprodukte von Cas13 aktiviert und verstärkt das Lichtsignal in der Probe und verbessert den Ablauf der Reaktion [38].
Die Methode CARMEN (combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids) kann als Weiterentwicklung von SHERLOCK betrachtet werden. Mit CARMEN können über 100 verschiedene Viren in einer Probe nachgewiesen werden. Zwei Reaktions-Tröpfchen werden benötigt, ein Proben-Tröpfchen und ein Detektions-Tröpfchen. Jedes dieser Tröpfchen enthält einen eindeutigen Farberkennungsfarbstoff. Die Tröpfchen werden auf einen Micowell-Chip geladen, die je zwei zufällige Tröpfchen aufnehmen, ein Proben-Tröpfchen und ein Detektions-Tröpfchen, und die Farbcodes werden aufgezeichnet. Die Detektions-Tröpfchen enthalten das Enzym Cas13 im Komplex mit einer guide-RNA, die die Erkennung einer bestimmten Ziel-RNA-Sequenz ermöglicht. Zusätzlich enthalten sie ein Reporter-Molekül, genau wie bei SHERLOCK. Die Proben-Tröpfchen enthalten die Virus-RNA aus einer Probe. Wird ein elektrisches Feld angelegt, vermischen sich Detektions-Tröpfchen und Proben-Tröpfchen und Cas13 wird, sofern die gesuchte Virus-RNA in der Probe ist, aktiviert und schneidet sowohl die Ziel-RNA als auch die Reporter-Moleküle. Das Lichtsignal der geschnittenen Reporter-Moleküle wird anschließend detektiert und lässt eine bestimmte virale Infektion bei der Person erkennen, von der die Probe stammt [42].
Abbildung entlehnt von [43] und [44].
Ein anderes Verfahren nennt sich DETECTR ( DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter ) und basiert auf Cas12 [41]. Cas12 schneidet ausschließlich DNA und wurde für den Nachweis von menschlichen DNA-Viren genutzt, indem das virale Erbgut zunächst vervielfältigt wurde. Alternativ könnte das Erbgut von RNA-Viren zunächst in DNA umgeschrieben und anschließend vervielfältigt werden. Die Vervielfältigung des viralen Erbguts erhöht die Chance, dass die Genschere die richtige Sequenz findet und schneidet. Auch bei DETECTR wird ein Reporter-Molekül verwendet, das allerdings das Fluorophor und den Quencher nicht mittels eines RNA-Moleküls verbindet, sondern passend für Cas12 durch ein DNA-Molekül [43]. Das Prinzip ist jedoch exakt das gleiche wie beim SHERLOCK-Test, sodass also das vervielfältigte Virus-Erbgut aus der Probe einer möglicherweise infizierten Person zusammen mit der Genschere Cas12 und der spezifischen crRNA zusammen in ein Reaktionsgefäß gegeben wird. Enthält die Probe das Virus, nach dem gesucht wird, führt die crRNA die Genschere zum entsprechenden Abschnitt der DNA, wodurch Cas12 aktiviert wird und sowohl die DNA schneidet, als auch die Reporter-Moleküle. Die geschnittenen Reporter-Moleküle senden ein Lichtsignal aus, welches detektiert werden kann [41]. DETECTR wurde bereits erfolgreich dafür verwendet, SARS-CoV-2 in Patientenproben zu ermitteln [28].
In einer Erweiterung des SHERLOCK-Tests konnten Patientenproben sogar gleichzeitig auf 169 verschiedene Viren untersucht werden [42]. Bei diesem Testverfahren namens CARMEN (
combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids ) wird ebenfalls zunächst das vorhandene Virus-Erbgut vervielfältigt. Anschließend wird das vervielfältigte Erbgut in einem winzig kleinen Tropfen Flüssigkeit mit einem bestimmten Farbstoff gemischt. In ein weiteres Tröpfchen werden das Enzym Cas13, eine crRNA zur Erkennung einer bestimmten Ziel-RNA-Sequenz und Reporter-Moleküle gegeben. Jedes Tröpfchen enthält einen eindeutigen Farbcode auf Farbstoffbasis. Die Tröpfchen werden auf einem Chip mit winzigen Vertiefungen aufgetragen, wobei immer nur zwei Tröpfchen in eine Vertiefung passen – je ein Tropfen mit viralem Erbgut und ein Tropfen mit dem Cas13 Enzym und den Reporter-Molekülen. Die jetzt vorliegenden Farbcodes werden aufgezeichnet. Nun wird ein elektrisches Feld angelegt, wodurch sich die beiden Tröpfchen miteinander vermischen. Wenn Cas13 mit Hilfe der crRNA seine Ziel-RNA in dem vervielfältigten Erbgut erkennt, wird Cas13 aktiviert und spaltet die Reporter-Moleküle. Dadurch entsteht ein einzigartiges Farbsignal, das eine bestimmte virale Infektion bei der Person, von der die Probe stammt, erkennen lässt [42, 44]. Mit CARMEN wurden bereits Infektionen mit SARS-CoV-2 nachgewiesen und es wurde gezeigt, dass CARMEN SARS-CoV-2 von den anderen menschlichen Coronaviren unterscheiden kann, darunter vier saisonale Coronaviren und die Coronaviren, die für das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS) bzw. das Middle East Respiratory Syndrome (MERS) verantwortlich sind [42].
Im Vergleich zu SHERLOCK und DETECTR ist CARMEN relativ kompliziert und muss in einem Labor durchgeführt und ausgewertet werden. CARMEN ist also eine großartige Methode, aber für den massenhaften Einsatz speziell in Pandemiezeiten nicht geeignet [44]. Aber auch SHERLOCK und DETECTR sind nicht perfekt für eine schnelle Diagnose: beide Verfahren benötigen bis zur Anzeige des Testergebnisses etwa eine Stunde [26-29]. Für einen breiten Einsatz mit raschem Testergebnis, muss das schneller gehen.
Ein neues Verfahren zum Nachweis von Infektionen mit SARS-CoV-2 dauert etwa 15 bis 30 Minuten [9]. Diese Methode kommt sogar ohne vorherige Vervielfältigung des Virus-Erbguts aus. Das Testverfahren trägt leider keinen schicken Namen, basiert aber ebenfalls auf der Genschere Cas13 und Reporter-Molekülen. Für den Nachweis von SARS-CoV-2 wurden bis zu drei unterschiedliche crRNAs in einen Reaktionsansatz gegeben, wodurch nicht nur das gesamte Erbgut des Virus abgedeckt wird, sondern auch genügend Cas13 Enzyme aktiviert werden, um ohne vorherige Vervielfältigung des viralen Erbguts eine nachweisbare Farbreaktion auszulösen. Durch das Wegfallen der Vervielfältigung des Erbguts wird Zeit gespart. Dass das Erbgut des Virus nicht vervielfältigt werden muss, hat aber nicht nur einen zeitlichen Vorteil. Im Vergleich zu den anderen Verfahren, erkennt dieser Test nicht nur, ob das Virus vorhanden ist, sondern misst auch, wie hoch die Viruslast ist [9]. Diese Information könnte Ärzten helfen, Behandlungsentscheidungen auf die Infektion einzelner Patienten abzustimmen.
Das Verfahren beinhaltet aber noch einen weiteren Clou. Das von den geschnittenen Reporter-Molekülen ausgesendete Lichtsignal wurde mit einer Handy-Kamera erfasst! Für den Nachweis des Lichtsignals wurde ein kleines Gerät gebaut, das eine kostengünstige Laser-Beleuchtung und Sammel-Optik enthält und letztlich mit einem Smartphone als Detektionsgerät kompatibel war [9]. Das ermöglicht eine breite Anwendung des Testverfahrens weitestgehend ohne besondere Labortechnik.
Nachweis einer SARS-CoV-2-Infektion durch CRISPR/Cas13 und Smartphone-Kamera
Indem mehrere verschiedene crRNAs bzw. guide-RNAs gegen das Erbgut des gleichen Virus eingesetzt werden, entstehen genügend Lichtsignale, um das Erbgut zuvor nicht vervielfältigen zu müssen. Das spart Zeit und lässt direkt auf die Viruslast in der untersuchten Probe schließen. Das gezeigte Verfahren funktioniert ähnlich wie die SHERLOCK-Methode und basiert ebenfalls auf CRISPR/Cas13. Das erzeugte Lichtsignal ist stark genug, um über eine Smartphone-Kamera ausgewertet zu werden. Der Aufbau zur Detektion mit dem Smartphone ist hier stark vereinfacht dargestellt und benötigt noch weitere Komponenten, die hier nicht gezeigt werden [9].
Ähnliche Artikel:
Vor- und Nachteile von CRISPR/Cas-basierten Virentests
Bislang sind die verschiedenen CRISPR/Cas-Anwendungen zum Nachweis von Virusinfektionen noch nicht ausreichend getestet worden, um sie als ernsthafte Alternative zur qRT-PCR oder zu Antikörpertests anzusehen. Dennoch zeigen die verschiedenen Testmethoden nicht nur auf, dass sich die CRISPR/Cas-Methode prinzipiell als Virentest nutzen lässt, sondern auch, wie schnell diese Methode anpassbar ist [44]. Verändert sich beispielsweise das Erbgut eines Virus aufgrund von Mutationen, muss nur die crRNA an die entsprechenden Mutationen angepasst werden [45, 46]. Auf diese Weise kann sogar zwischen verschiedenen Virusmutanten unterschieden werden. Beispielsweise konnte das CARMEN-Verfahren bei der Untersuchung von Proben von HIV-Infizierten sechs bekannte virale Mutationen nachweisen, die mit Medikamentenresistenz verbunden sind [42].
Ein riesiger Vorteil der CRISPR/Cas-basierten Tests ist ihre Schnelligkeit und die Einfachheit der Komponenten. Bis auf CARMEN benötigen die Testverfahren keine Laborumgebung und können stattdessen auch problemlos in Arztpraxen oder sogar zu Hause durchgeführt und ausgewertet werden. Die Ergebnisse liegen in etwa einer oder einer halben Stunde vor [9, 26, 28, 29]. Hier muss sich allerdings noch zeigen, ob die CRISPR/Cas-Tests zuverlässigere Ergebnisse liefern als Antikörpertests und somit wirklich vorteilhafter sind.
Ein großer Nachteil der meisten CRISPR/Cas-basierten Testverfahren ist die Vervielfältigung des viralen Erbguts. Bei diesen Abläufen besteht die Gefahr einer Kontamination, sodass Ansätze, die ohne eine Vervielfältigung auskommen, definitiv einen Vorteil haben [9]. Der zweite Nachteil ist die Erzeugung falsch-positiver Ergebnisse aufgrund möglicher Off-target-Effekte. Diese treten auf, wenn die crRNA an nicht hundertprozentig richtige Ziel-RNA-Sequenzen bindet und die Genschere somit fälschlicherweise aktiviert wird. Beim Genome Editing unter Einsatz von CRISPR/Cas9 sind solche Off-target-Effekte extrem ärgerlich, da ungewollte Schnitte im Erbgut einer Zelle verursacht werden [47, 48]. Es könnte sein, dass Off-target-Effekte beim Einsatz von Cas12 und Cas13 zur Detektion von Viren zu falschen Nachweisreaktionen führen. Zu diesem Problem müssen allerdings erst noch mehr Experimente durchgeführt werden.
Prinzipiell ist die Nutzung des CRISPR/Cas-Verfahrens zum Nachweis von Virusinfektionen eine großartige Idee. Die Verfahren sind schnell, spezifisch und bestehen aus Komponenten, die eine Nutzung außerhalb von Laboren zulassen. Weitere Experimente und Studien müssen jedoch noch zeigen, ob solche Testverfahren eine gleichwertige Alternative zur
qRT-PCR darstellen.
Dazu passend:
Ein Video zum SHERLOCK-Verfahren (englisch; von User "Broad Institute", hochgeladen am 13.04.2017):
Ein Video zu CRISPR-basierten Diagnostik-Verfahren (englisch; von User "Innovative Genomics Institute - IGI", hochgeladen am 18.10.2018):
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